本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的三聚氰胺和微孔条上预包被的偶联抗原竞争三聚氰胺抗体配制样品稀释液：称取89.5 g Na2HPO4·12H2O ，蒸馏水定容至1000 mL。湿的宠物食品萃取方法（稀释100倍）1．匀质样品到布丁状；2．称取2 g样品加入10 mL 60%甲醇水溶液，并剧烈振荡；3．超声萃取1 min，漩涡混合1 min，然后静止5 min，使样品分层；4．5000 rmin室温离心5 min，用玻璃纤维滤纸过滤上清液，并将其收集于干净试管中；5．用样品稀释液将滤液20倍稀释；6．取50 μL进行实验。干的宠物食品萃取方法（稀释200倍）1．均质干的宠物饲料样品；2．称取1 g样品加入10 mL 60%甲醇水溶液，并剧烈振荡；3．超声萃取1 min，漩涡混合1 min，然后静止5 min，使样品分层；4．5000 rmin室温离心5 min，用玻璃纤维滤纸过滤上清液，并将萃取液收集于干净试管中；6．用样品稀释液将滤液20倍稀释；7．取50 μL进行实验。操作说明：1．将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温（20～26℃）下平衡30min以上，将需用的板条放入支架，按顺序编号；2．洗液配制：将50 mL浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水稀释至1000 mL备用（或按需量稀释）；3．在标准品孔中加入50 μL标准品，样品孔加入50 μL待测样品，然后每孔加入50 μL抗体（加入标品和样品时无时间差的影响），轻拍混匀，37℃下孵育40 min；4．倒出孔中的液体，用洗板机洗涤4～6遍；没有洗板机的用户可用300 μL洗液充入各孔中，静置20 s，倒出孔中的液体，将微孔架倒置，在吸水纸上连续拍打3次以上，以保证完全除去孔中的液体，重复操作4～6遍；5．加入酶标记物100 μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃ 环境中反应20 min，取出重复洗板步骤；6．显色：每孔加入底物缓冲液50 μL，再加底物液50 μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，置37℃ 环境中反应10 min；7．测定：每孔加入终止液50 μL，轻轻振荡混匀．设定酶标仪于450 nm处，测定每孔OD 值，根据标准曲线计算样品浓度。